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Die wiederholte Exposition des Menschen gegenüber inhalierten oxidativen Noxen unterschiedlicher Genese ist ein wesentlicher Faktor bei der Entstehung umweltinduzierter Erkankungen. Zu diesen Noxen gehört neben arbeitsplatzbezogenen Noxen in Form aggressiver Gase und Partikel insbesondere der inhalative Zigarettenrauch (aktiv wie passiv) als Hauptschadstoffbelastung im Innenraumbereich. Das aktive Rauchen, und in geringerem Maße das Passivrauchen, können die Entstehung einer chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) bewirken. Über die genannten Noxen hinaus kann die Entwicklung der Erkrankung durch andere Umwelt- und Verhaltensfaktoren begünstigt werden. Eine pathophysiologisch bedeutsame Komponente der COPD ist das Lungenemphysem. Es ist durch eine Zerstörung der alveolären Strukturen gekennzeichnet, die sich im Verlust der elastischen Spannung der Lunge und ihrer Gasaustauschfähigkeit widerspiegelt. Da Fibroblasten eine Schlüsselrolle in der Aufrechterhaltung der Struktur der Lunge spielen, fokussierte die vorliegende Arbeit auf umweltinduzierte Veränderungen im Verhalten dieses Zelltyps. Sie ging von der Beobachtung aus, dass Raucher häufig Zeichen einer vorgezogenen Alterung aufweisen, dass oxidative Noxen Zellen in Kultur in einen gealterten Zustand versetzen können, dass gealterte Zellen eine geringere Bereitschaft zur Zellteilung zeigen und dass die Erkrankung Zeichen eines autonomen Progresses aufweist, der nicht alleine durch akute Entzündung erklärt werden kann. Daraus ergab sich die Hypothese, dass parenchymale, d.h. dem alveolären Bereich entstammende Fibroblasten der Lunge Zeichen einer vorgezogenen Alterung (Seneszenz) im Vergleich zu den Zellen von Rauchern ohne Lungenemphysem aufweisen. Derartige Änderungen hätten die Störung der Regeneration der Lunge und somit einen Gewebeabbau im Verlauf der Jahre zur Folge. Im Rahmen dieser Arbeit sollte somit geklärt werden, (1) ob und wie sich das Wachstum der Fibroblasten beim Lungenemphysem von demjenigen der Kontrollzellen unterscheidet, (2) ob der Phänotyp der Fibroblasten von Patienten mit Emphysem Zeichen einer vorzeitigen Alterung aufweist, (3) welche für eine zelluläre Seneszenz möglicherweise relevanten Gene unter den standardisierten Bedingungen der Kultur eine dauerhaft veränderte Expression aufweisen. Auf dieser Basis wurden Lungenfibroblasten aus Operationsresektaten von Patienten mit und ohne Emphysem untersucht. Die Charakterisierung der aus Explantaten gewonnenen Kulturen umfasste zunächst eine Reinheitsbestimmung der Zellkulturen. Hierbei ergab sich, dass in der zweiten Passage nach Primärkultur die Fibroblasten nahezu in Reinkultur vorlagen. Sodann wurde die Zellteilungsrate der Fibroblastenkulturen in beiden Gruppen während der exponentiellen Wachstumsphase quantifiziert. Es wurde eine signifikant verminderte Verdopplungsrate der Fibroblasten von Patienten mit Emphysem beobachtet. Da die Zellen im Abstand von 5-6 Wochen von der Entnahme untersucht wurden, ließ sich schließen, dass die Fibroblasten der Patienten mit Emphysem intrinsisch verändert waren und nicht akuter inflammatorischer Reize bedurften, um sich anders als die Kontrollzellen zu verhalten. Gealterte Zellen unterscheiden sich von nicht gealterten Zellen nicht nur durch eine geringere Teilungsrate, sondern auch durch eine geringere maximale Zahl von Teilungen. 2 Daher wurde in Langzeitkulturen untersucht, ob die langsamere Proliferation beim Emphysem mit einer geringeren proliferativen Kapazität einhergeht bzw. ob die Fibroblasten bei genügend großer zur Verfügung stehender Zeit die gleiche maximale Zahl von Teilungen erreichen, wie die Kontrollzellen. Die Unterschiede der initialen Steigung der Zellteilungskurven waren gleichsinnig zu den in den Kurzzeitversuchen beobachteten Unterschieden. Der Median der maximalen Zahl der Populationsverdopplungen bis zur Stagnation des Wachstums in serieller Passage lag bei den Zellen der Patienten mit Emphysem um ca. 6 Verdopplungen niedriger, wenn auch wegen der großen Streuung innerhalb der Gruppen der Unterschied nicht statistisch signifikant war. Die Analyse der initialen Form der Kurven ergab ebenfalls eine Verschiebung um 6 Verdopplungen bei den Zellen der Patienten mit Emphysem. Dieser Befund bestätigte die Annahme, dass die verminderte Proliferationsrate der Lungenfibroblasten von Patienten mit Emphysem persistierende, intrinsische Änderungen widerspiegelte. Als phänomenologischer Indikator der Zellalterung wurde im nächsten Schritt die Expression der Seneszenz-assoziierten beta-Galaktosidase untersucht. In der Tat fand sich in den Zellen der Patienten mit Lungenemphysem eine signifikant stärkere Aktivität dieses Enzyms, im Sinne einer zellulären Seneszenz. Die Validität dieses Nachweises konnte mittels serieller Anfärbungen bestätigt werden. Einer chronologischen zellulären Alterung liegt i.a. als zentraler Mechanismus die Verkürzung der am Ende der Chromosomen befindlichen Telomeren zugrunde, die als Abwärtszähler der verbleibenden Zellteilungskapazität fungieren. Daher wurden mit Hilfe einer immunologischen Technik die Telomerenlängen vergleichend untersucht. Die Telomerenlängen waren nicht zwischen den Gruppen verschieden und die Wahrscheinlichkeit eines dennoch bestehenden Unterschiedes konnte auf einen Wert von weniger als 5 % berechnet werden. Daher scheint die beobachtete reduzierte Proliferationsrate auf Telomeren-unabhängigen Mechanismen zu beruhen; dies spricht stärker für den Typ einer durch Noxen induzierten als einer chronologischen Seneszenz. Um einen Überblick über die Mechanismen zu gewinnen, die eine derartige Form der Seneszenz charakterisieren, wurde mit Hilfe eines 12.000 Gene umfassenden cDNA-Arrays (Genchip) die Expression (mRNA) einer für das Genom repräsentativen Menge von Genen in Zellkultur exploriert. Eine Auswahl der auf diese Weise qualitativ identifizierten Gene wurde dann in unabhängig angezogenen Zellkulturen mit Hilfe der quantitativen Echtzeit-PCR (qPCR) auf ihre Expression hin überprüft. Der explorative cDNA-Array wurde mit zusammengefassten Proben jeweils dreier Fibroblastenkulturen von Patienten mit und ohne Emphysem durchgeführt; er zeigte summarisch eine größere Zahl ab- als aufregulierter Gene beim Emphysem. Die im Array beobachteten Unterschiede der Genexpression zwischen den Gruppen konnten in der qPCRUntersuchung für die bekanntermaßen Seneszenz-assoziierten Gene IGFBP-3 und IGFBPrP1 bestätigt werden, die beim Emphysem signifikant aufreguliert vorlagen. Beide Gene codieren für Proteine, die die Effekte von Insulin und Insulin-artigen Faktoren steuern. Eine unterschiedliche Expression anderer Gene, die nach Literaturbefunden mit zellulärer Seneszenz assoziiert sind und im Array in der Regel unterschiedlich ausgeprägt gefunden wurden, ließ sich in der qPCR nicht bestätigen; dies betraf FOSL1, LOXL2, OAZ1, CDK4, IGFBP-5, - rP2 (CTGF) und -rP4 (Cyr61). Da eine unterschiedliche Genexpression nicht notwendigerweise eine unterschiedliche Proteinsynthese nach sich zieht, wurde zusätzlich die Proteinmenge von IGFBP-3 im Überstand der Zellkulturen analysiert. In Übereinstimmung mit den Expressionsbefunden fand sich IGFBP-3 vermehrt bei Fibroblasten, die von Patienten mit Emphysem stammten. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass parenchymale Lungenfibroblasten von Patienten mit Lungenemphysem eine verminderte Proliferationsrate und -kapazität besitzen. In Verbindung mit den Daten der Anfärbung für einen zellulären Seneszenzmarker spricht dies für das Vorliegen eines seneszenten zellulären Phänotyps beim Emphysem. Die Tatsache, dass einerseits die Änderungen in Kultur persistierten und dass andererseits kein Unterschied der Telomerenlängen bestand, legt eine durch epigenetische Mechanismen vermittelte induzierte Seneszenz der Zellen nahe. Die mittels gestaffelter Analyse der Genexpression gefundene Aufregulation von anti-proliferativen Proteinen der Insulinachse wie IGFBP-3 und IGFBP-rP1 in Lungenfibroblasten von Patienten mit Emphysem erlaubt es darüber hinaus, eine Verbindung zwischen dem lokalen Verhalten von Strukturzellen und systemischen, über Insulin und insulinartige Wachstumsfaktoren vermittelten Änderungen zu schlagen. Diese Daten sind neuartig und erscheinen hilfreich für das Verständnis der Pathogenese des Lungenemphysems. Da sie modellhaft das Ergebnis einer chronischen Belastung mit einer Noxe auf Zellen widerspiegeln, ist anzunehmen, dass der in dieser Arbeit verfolgte Ansatz und die diesen Ansatz bestätigenden Daten auch für das Verständnis anderer, durch Umwelt und/oder Verhalten induzierter Erkrankungen förderlich sind.
Recently polyfluoroalkyl compounds (PFCs) were discovered as emerging persistentorganic pollutants. Because of their unique physicochemical properties due to theircombination of lipophilic and hydrophilic characteristics, PFCs have been widely used inmany consumer products, such as polymerisation aids, stain repellents on carpets, textiles, andpaper products for over 50 years. From the production and use of these products, PFCs can bereleased into the environment. Scientific concern about PFCs increased due to their globaldistribution and ubiquitous detection in the environment, especially in marine mammals.An analytical protocol was developed for the analysis of PFCs in water samples andvarious biological matrices. The samples were analysed for 40 PFCs plus 20 isotope-labelledinternal standards using high performance liquid chromatography/negative electrosprayionisation-tandem mass spectrometry (HPLC/(-)ESI-MS/MS). Furthermore, the analyticalquality of the laboratory has been approved in interlaboratory studies.In the first part of this Ph.D. thesis was investigated the occurrence, distribution patternand transportation mechanisms of PFCs in seawater. The rivers had a high influence on thedistribution of PFCs in offshore surface water in the German Bight, with decreasingconcentrations with increasing distance from the coast (see publication I). The research onthe spatial distribution of PFCs in coastal area is very important for the understanding of thetransportation and fate of PFCs in the marine environment. Furthermore, the longitudinal andlatitudinal distribution of PFCs in surface water of the Atlantic Ocean was investigated (seepublication II). The results indicate that trans-Atlantic Ocean currents caused the decreasingconcentration gradient from the Bay of Biscay to the South Atlantic Ocean and theconcentration drop-off close to the Labrador Sea. These data are very useful for globaltransportation models, in which industrial areas are considered as sources, and ocean watersas sinks of PFCs.The second part of this Ph.D. thesis examined the mechanisms and pathways of PFCs inharbor seals (Phoca vitulina) and their temporal trends in the German Bight. Firstly, thewhole body burden of PFCs and their tissue distribution (i.e., liver, kidney, lung, heart, blood,brain, muscle, thyroid, thymus, and blubber) was investigated in harbor seals (seepublication III). This study is relevant for calculation of the bioaccumulation potential ofthese compounds in marine mammals. Secondly, the temporal trends over the last decade andassociations between PFC concentration and the evidence of diseases, spatial distribution, ageand sex were evaluated in archived harbor seal livers (see publication IV). The results showsignificant declining concentrations of many PFCs indicating the replacement of these PFCsby shorter chained and less bioaccumulative compounds.Several studies were performed besides the main issue of the Ph.D. work. Firstly, watersamples were collected along the river Elbe into the North Sea to examine the distribution ofPFCs in the dissolved and particulate phase, their discharge into the North Sea, and theinfluence of waste water treatment plant effluents to the riverine mass flow. Furthermore,surface water samples were collected in the North Sea, Baltic Sea and Norwegian Sea, wherethe occurrence and spatial distribution between river estuaries, coastal waters, in brackish aswell as salt water, and open sea water were compared. Finally, within the frame of a researchstay at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) in Japan,the partitioning behaviour of PFCs between pore water and sediment in two sediment coresfrom Tokyo Bay was investigated.This Ph.D. thesis has improved our knowledge of the occurrence and distribution of PFCsin water and biota highlighting association between PFCs and pathological conditions,potential sources and sinks, spatial distribution, and changes in their pattern and long-termperspective trends.