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Entwicklung eines Zellkulturmodells zur Untersuchung des Schadstoffeinflusses auf Seehunde (Phoca vitulina)

Development of a cell culture model to assess the impact of pollutants on harbour seals (Phoca vitulina)

  • Der Seehund wird in Monitoring-Programmen zum Zustand des Ökosystems Wattenmeer (z.B. TMAP) als ein Indikatororganismus genutzt. Aufgrund der Position im Nahrungsnetz (Top-Prädatoren) und der langen Lebensspanne sind Seehunde besonders stark mit Schadstoffen belastet, u.a. mit Polychlorierten Biphenylen (PCB) und Perfluoroctansulfonat (PFOS). Zahlreiche Studien deuten darauf hin, dass die Schadstoffbelastung die Gesundheit der Seehunde beeinträchtigt. Das Ziel unserer Arbeitsgruppe ist die Identifizierung neuer Biomarker, die im Lebendmonitoring von Seehunden eingesetzt werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Ausarbeitung und Etablierung eines Zellkulturmodells, welches in weiterführenden Arbeiten die Identifizierung der Biomarker ermöglicht. Als Biomarker sollen Proteinmuster verwendet werden, die eine Früherkennung von schadstoffbedingten Veränderungen in der Seehundpopulation ermöglichen. Da Hepatozyten an der Metabolisierung von Xenobiotika beteiligt sind, werden sie für das Zellkulturmodell verwendet. Von den Hepatozyten werden in vivo Plasmaproteine synthetisiert, die bei in vitro Experimenten im Zellkulturmedium nachweisbar sind. Diese Proteine könnten anschließend als Biomarker in einem Lebendmonitoring (Blutproben) an Seehunden eingesetzt werden. Für das Zellkulturmodell wurden primäre Seehund-Hepatozyten mit Schadstoffen (PCB, PFOS) in umweltrelevanten Konzentrationen inkubiert. Als Kontrolle dienten Zellen, die nur mit dem jeweiligen Lösungsmittel inkubiert wurden (Isooctan für PCB; DMSO für PFOS). Da in der Literatur bisher keine Isolierung von Hepatozyten aus marinen Säugern beschrieben wurde, musste eine geeignete Isolierungsmethode etabliert werden. Die Methode musste die Isolierung vitaler Hepatozyten aus bereits verstorbenen Tieren in ausreichend hoher Menge ermöglichen. Es wurden verschiedene Isolierungsmethoden getestet von denen sich nur die Leberbiopsie Perfusion eignete. Sämtliche Parameter müssen mit den sich anschließenden Proteomanalysen kompatibel sein. Die Hepatozyten müssen ihre Vitalität nach der Isolierung und während der Kultivierung beibehalten. Zur Analyse der Vitalität wurden der XTT- und LDH-Test (allgemeiner Stoffwechsel und Membranintegrität) angewendet sowie die Harnstoffsynthese (leberspezifischer Stoffwechsel) beurteilt. Mit Hilfe der Zelltests wurde die Vitalität der Hepatozyten im Verlauf einer dreitägigen Kultivierung untersucht und der Einfluss einer Schadstoffinkubation auf die Zellvitalität analysiert. Die Schadstoffe sollen in den eingesetzten Konzentrationen keinen Einfluss auf die Zellvitalität oder Morphologie haben. Die Ergebnisse aus den Vitalitätstests zeigten, dass die verwendeten PCB-Konzentrationen keinen signifikanten Einfluss auf die Vitalität hatten. Eine Aussage zum Einfluss einer PFOSInkubation auf die Zellen (XTT- und Harnstoff-Test) konnte nicht gemacht werden, da die DMSO-Konzentration in den Proben zu hoch gewählt wurde. Die PFOSInkubation hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Membranintegrität. Anhand erster Testreihen, die in unserer Arbeitsgruppe realisiert wurden, konnte die Funktionalität des Zellkulturmodells überprüft werden. Hierzu wurden Proteomanalysen von Seehund-Hepatozyten durchgeführt, die mit PCB inkubiert wurden. Erste Ergebnisse zeigten, dass es zu einer signifikanten Hochregulierung der Expressionslevel einiger Proteine kam, die am Schadstoffabbau beteiligt sind. In der vorliegenden Arbeit wurde erfolgreich ein Zellkulturmodell mit primären Seehund-Hepatozyten entwickelt, welches die Identifizierung neuer Biomarker für Seehunde ermöglicht.
  • Within the Trilateral Monitoring and Assessment Program for the Wadden Sea harbour seals (Phoca vitulina) are considered as sensitive indicators for the status of the Wadden Sea ecosystem. Due to their position as top predators in the marine food web and their long live spans, harbour seals are particularly burdened with persistent pollutants like polychlorinated biphenyls (PCBs) and perfluorooctane sulfonate (PFOS). These pollutants accumulate in the food web and numerous studies are indicating that they can cause severe effects on the health of chronically exposed organisms. The present study contributes to current efforts undertaken to identify novel biomarkers for pollutant exposure of wild-ranging seals. For the early diagnosis of disorders caused by anthropogenic pollutants, pollutant-induced up- or downregulation of protein expression in hepatocytes presents a potential marker. The aim of the present work was the elaboration of a cell culture model that enables the identification of proteins suiting those biomarker properties. For this purpose primary seal hepatocytes were incubated with pollutants in environmental relevant concentrations. Cells for a control group were only incubated with the respective solvent (isooctane for PCBs; DMSO for PFOS). So far no description of an isolation procedure of hepatocytes from marine mammals has been published. In consequence, the initial aim of this thesis was to set up an appropriate isolation method for seal hepatocytes. Different methods of cell isolation have been established and compared within the scope of this study. Only the liver biopsy perfusion method turned out to be useful. Successful application of the cell culture model requires the maintenance of the hepatocytes in vivo functions and viability during the three days of cultivation. Three viability assays were applied to assess overall functional cell viability (XTT assay), the hepato-specific urea synthesis and the membrane integrity (LDH assay). By means of these cell assays, the viability of the hepatocytes was examined and the impact of the pollutant’s incubation was analysed. The applied pollutant’s concentration should not have any detectable influence on the cell’s general viability or morphology. The results of the three viability tests showed that isooctane and the applied PCB concentrations had no negative impact on the cell’s viability. Conclusions on the impact of the incubation with PFOS on urea synthesis and overall functional cell viability could not be made due to the high DMSO concentrations in the samples. The incubation with PFOS had no detectable effect on the membrane integrity as indicated by the LDH assay. The functionality of the cell culture model was assessed through a preliminary series of tests conducted within our workgroup. Therefore proteome analyses of seal hepatocytes which were incubated with 1 μM, 50 μM or 100 μM PCB were performed. First results showed that the protein expression level of some proteins were significantly up-regulated. Sequence analyses suggested that these proteins belong to the cytochrome P450 enzyme complex. This enzyme complex is known to be involved in the degradation of xenobiotics, particular PCBs. Due to pollutant impact, the production of these proteins increases and an up-regulation of the expression level is expected. Therefore, the functionality and applicability of the cell culture model seems to be a valid approach for the identification of potential biomarker.

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Metadaten
Author:Antonia Wargel
URN:urn:nbn:de:gbv:luen4-opus-142051
URL: https://pub-data.leuphana.de/frontdoor/index/index/docId/593
Advisor:Wolfgang Ruck (Prof. Dr.)
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Year of Completion:2010
Date of Publication (online):2011/08/25
Publishing Institution:Leuphana Universität Lüneburg
Granting Institution:Leuphana Universität Lüneburg, Nachhaltigkeit
Date of final exam:2011/06/28
Release Date:2011/08/25
Tag:Hepatozyten; PCB; PFOS; Seehund; phoca vitulina
PCB; PFOS; hepatocytes; phoca vitulina; seals
GND Keyword:Seehund; Leberepithelzelle; Polychlorierte Biphenyle
Institutes:Fak 3 - Umwelt und Technik (alt) / Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften